TTP Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-400722-LAC

Lo ZFP36 umano codifica la tristetraprolina (TTP), una proteina legante l’RNA che si lega agli elementi ricchi in AU e promuove una rapida deadenilazione e degradazione degli mRNA, limitando così l’espressione di mediatori dell’infiammazione e di geni a risposta immediata. TTP recluta il complesso CCR4–NOT e altri componenti del macchinario di degradazione per regolare il turnover dei trascritti, modulando la segnalazione dell’immunità innata, le risposte allo stress e i circuiti di controllo a feedback delle vie citochiniche come TNF/NF-κB e MAPK. Un’attività deregolata di ZFP36/TTP è associata a una produzione anomala di citochine e a infiammazione cronica, e un’espressione alterata è stata riportata in vari contesti di disregolazione immunitaria e in fenotipi correlati al cancro legati al controllo post-trascrizionale. In quanto nodo nelle reti di stabilità degli mRNA, ZFP36 è ampiamente utilizzato per studiare la degradazione dell’RNA, i programmi di attivazione dei macrofagi e il rimodellamento del trascrittoma dipendente dalla segnalazione.

Le particelle di attivazione lentivirale TTP (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di ZFP36 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale TTP (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione ZFP36, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di TTP. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo ZFP36 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.