TRα Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401475-ACT

THRA codifica per il recettore dell’ormone tiroideo alfa (TRα), un recettore nucleare attivato dal ligando che si lega agli elementi di risposta all’ormone tiroideo per regolare programmi trascrizionali che controllano il metabolismo cellulare, la proliferazione, la differenziazione e lo sviluppo. La segnalazione di TRα si integra con il rimodellamento della cromatina dipendente da coregolatori e interagisce con vie che governano la funzione mitocondriale, il controllo del ciclo cellulare e l’espressione genica specifica di tessuto. Un’attività deregolata del recettore dell’ormone tiroideo e un’alterata espressione di THRA sono state associate ad anomalie dello sviluppo e a fenotipi legati al sistema endocrino, e i programmi trascrizionali dipendenti da TRα sono spesso studiati in contesti quali la biologia cardiaca, scheletrica e neurale. In quanto nodo di fattore di trascrizione, THRA viene anche utilizzato per analizzare reti geniche responsivi agli ormoni e meccanismi epigenetici di regolazione dell’espressione genica nelle cellule umane.

TRα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di THRA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus THRA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione THRA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRα. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus THRA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRα nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRα nelle cellule tumorali con espressione di THRA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.