Tomosyn Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403625-ACT

STXBP5 umano codifica tomosina, una proteina legante la sintaxina che regola l’assemblaggio del complesso SNARE e il priming delle vescicole, modulando la fusione di membrana e l’esocitosi. Interagendo con le t‑SNARE della membrana plasmatica, la tomosina influenza la secrezione regolata in contesti neuronali ed endocrini, plasmando la dinamica di rilascio di neurotrasmettitori e ormoni. La modulazione del traffico vescicolare mediata da STXBP5 è stata studiata in vie che governano la trasmissione sinaptica, il rilascio dei granuli piastrinici e la secrezione di insulina, collegandone l’attività a fenotipi cardiometabolici e neurobiologici. Un’alterata espressione o funzione della tomosina può perturbare reti di segnalazione dipendenti dalla secrezione, rendendo STXBP5 un nodo utile per indagare la fusione vescicolare deregolata in modelli cellulari rilevanti per la malattia.

Tomosyn Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STXBP5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Tomosyn Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STXBP5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STXBP5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Tomosyn. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STXBP5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Tomosyn nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Tomosyn nelle cellule tumorali con espressione di STXBP5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.