TEF-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402093-ACT

Il TEAD4 umano codifica il fattore di trascrizione TEF-3, una proteina di legame al DNA della famiglia dei domini TEA che funge da principale effettore nucleare della via Hippo attraverso interazioni con i co-attivatori YAP/TAZ. TEF-3 regola programmi genici che controllano proliferazione e sopravvivenza cellulare, le transizioni epitelio-mesenchimali e la specificazione di linea durante lo sviluppo, con bersagli a valle arricchiti in vie legate alla crescita e al rimodellamento del citoscheletro. Un’alterazione dell’output trascrizionale di TEAD4/TEF-3 è stata associata a cambiamenti dell’omeostasi tissutale e a contesti di segnalazione oncogenica in cui il controllo della via Hippo è compromesso. Di conseguenza, TEAD4 è spesso studiato come nodo che collega la meccanotrasduzione e le decisioni sul destino cellulare a stati trascrizionali rilevanti per la malattia.

TEF-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TEAD4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TEF-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TEAD4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TEAD4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TEF-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TEAD4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TEF-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TEF-3 nelle cellule tumorali con espressione di TEAD4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.