TDAG51 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401042-ACT

PHLDA1 codifica TDAG51, una proteina contenente un dominio simile alla pleckstrin homology, che viene rapidamente indotta dallo stress cellulare e dalla segnalazione dei fattori di crescita e può modulare programmi di apoptosi, proliferazione e differenziamento. TDAG51 partecipa alle risposte trascrizionali allo stress e si interfaccia con vie quali la segnalazione MAPK e PI3K/AKT, influenzando la progressione del ciclo cellulare e le decisioni di sopravvivenza. Un’espressione alterata di PHLDA1 è stata riportata in molteplici contesti tumorali e in condizioni infiammatorie, dove spesso viene utilizzata come marcatore delle transizioni di stato cellulare e di fenotipi adattativi allo stress. Queste caratteristiche rendono TDAG51 un nodo utile per analizzare come la segnalazione di stress e i programmi di lineage rimodellino l’espressione genica e il destino cellulare in sistemi modello umani.

TDAG51 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PHLDA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TDAG51 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PHLDA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PHLDA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TDAG51. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PHLDA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TDAG51 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TDAG51 nelle cellule tumorali con espressione di PHLDA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.