Tctex1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402886-ACT

DYNLT1 umano codifica Tctex1, una catena leggera della dineina che si assembla con la dineina citoplasmatica per sostenere il trasporto basato sui microtubuli, il posizionamento degli organelli e il traffico intracellulare. Attraverso interazioni all’interno del complesso motore dineina–dynactina, Tctex1 contribuisce a processi quali l’organizzazione del fuso mitotico, la funzione del centrosoma e il movimento del carico, che modellano la polarità cellulare e la divisione. Il trasporto dipendente da DYNLT1 è stato collegato alla biologia neuronale e ciliare tramite la regolazione della localizzazione delle proteine e la compartimentalizzazione della segnalazione. La disregolazione delle vie di trasporto associate alla dineina è spesso studiata nel contesto di meccanismi neurodegenerativi e di stati proliferativi alterati, rendendo DYNLT1 un nodo utile per indagare la dinamica del citoscheletro e gli esiti della segnalazione.

Tctex1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DYNLT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Tctex1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DYNLT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DYNLT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Tctex1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DYNLT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Tctex1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Tctex1 nelle cellule tumorali con espressione di DYNLT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.