TBK1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401066-ACT

La TBK1 umana (TANK-binding kinase 1) è una chinasi serina/treonina che integra i segnali dell’immunità innata e dello stress, agendo a valle dei recettori di riconoscimento dei pattern (pattern-recognition receptors) per indurre risposte a interferone di tipo I attraverso la fosforilazione di IRF3/IRF7. TBK1 modula anche la segnalazione di NF-κB e regola l’autofagia selettiva e la mitofagia tramite la fosforilazione di recettori dell’autofagia come OPTN e p62/SQSTM1, collegando la segnalazione infiammatoria al controllo qualità cellulare. Un’attività deregolata di TBK1 è stata associata a fenotipi infiammatori cronici e a processi neurodegenerativi, e varianti loss-of-function di TBK1 sono implicate nel rischio di SLA/FTD attraverso un’autofagia compromessa e una segnalazione immunitaria alterata. Queste proprietà rendono TBK1 un nodo chiave per lo studio della segnalazione cGAS–STING, delle risposte antivirali e della proteostasi associata all’autofagia in modelli cellulari umani.

TBK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TBK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TBK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TBK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TBK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TBK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TBK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TBK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TBK1 nelle cellule tumorali con espressione di TBK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.