Stim1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401311-ACT

STIM1 codifica la stromal interaction molecule 1 (Stim1), un sensore del Ca2+ del reticolo endoplasmatico che avvia l’ingresso di calcio dipendente dallo svuotamento dei depositi (SOCE) accoppiando la deplezione di calcio del RE all’attivazione dei canali ORAI nei siti di contatto tra RE e membrana plasmatica. Questo asse di segnalazione del calcio coordina oscillazioni citosoliche di Ca2+ che regolano programmi trascrizionali, rimodellamento del citoscheletro, secrezione e progressione del ciclo cellulare attraverso vie che includono la segnalazione calcineurina–NFAT e MAPK. Il SOCE dipendente da STIM1 è un determinante centrale dell’attivazione delle cellule immunitarie e, più in generale, dell’omeostasi del calcio in molti tessuti. Un’attività di STIM1 deregolata e dinamiche alterate dell’ingresso di Ca2+ sono state associate a una segnalazione infiammatoria modificata, a funzioni neuromuscolari alterate e a fenotipi rilevanti per il cancro, come migrazione e adattamento metabolico, supportandone l’uso come nodo meccanicistico nella modellizzazione delle malattie.

Stim1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STIM1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Stim1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STIM1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STIM1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Stim1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STIM1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Stim1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Stim1 nelle cellule tumorali con espressione di STIM1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.