SP-lyase CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422908-ACT

Das Mausgen **Sgpl1** kodiert die Sphingosin-1-phosphat-(S1P)-Lyase (SP-Lyase), ein mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziiertes Enzym, das S1P irreversibel abbaut und damit die Signalübertragung innerhalb des sphingolipidischen Stoffwechselnetzwerks beendet. Durch die Kontrolle intra- und extrazellulärer S1P-Spiegel beeinflusst die SP-Lyase die Lipid-Rheostase sowie nachgeschaltete Signalwege, die Zellüberleben, Stressantworten, Migration und das Trafficking von Immunzellen steuern. Eine veränderte SGPL1-Aktivität stört die Ceramid–Sphingosin–S1P-Achse und wurde in Modellsystemen mit inflammatorischen Phänotypen, metabolischer Dysregulation sowie neuro-renaler Pathobiologie in Verbindung gebracht. Daher wird dieses Gen häufig eingesetzt, um den Sphingolipid-Flux, Barriere-/vaskuläre Signalgebung und Mechanismen der Immunhomöostase zu untersuchen.

SP-lyase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Sgpl1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SP-lyase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Sgpl1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Sgpl1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SP-lyase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Sgpl1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SP-lyase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SP-lyase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Sgpl1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.