SP-lyase Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422908-ACT

Nel topo, Sgpl1 codifica la liasi della sfingosina-1-fosfato (S1P), un enzima associato al reticolo endoplasmatico che degrada irreversibilmente l’S1P per terminare la segnalazione all’interno della rete metabolica degli sfingolipidi. Controllando i livelli intra- ed extracellulari di S1P, la liasi della S1P influenza la reoestasi lipidica e le vie a valle che regolano la sopravvivenza cellulare, le risposte allo stress, la migrazione e il traffico delle cellule immunitarie. Un’alterata attività di SGPL1 perturba l’asse ceramide–sfingosina–S1P ed è stata collegata, in sistemi modello, a fenotipi infiammatori, deregolazione metabolica e patobiologia neuro-renale. Questo gene è quindi ampiamente utilizzato per studiare il flusso degli sfingolipidi, la segnalazione di barriera/vascolare e i meccanismi di omeostasi immunitaria.

SP-lyase Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Sgpl1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SP-lyase Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Sgpl1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Sgpl1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SP-lyase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Sgpl1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SP-lyase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SP-lyase nelle cellule tumorali con espressione di Sgpl1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.