SLC43A1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417236-ACT

SLC43A1 codifica un trasportatore di amminoacidi neutri di grandi dimensioni, indipendente dal sodio (LAT3), che facilita l’assorbimento cellulare di amminoacidi a catena ramificata e di altri amminoacidi essenziali, supportando il sensing dei nutrienti e il metabolismo anabolico. Modulando la disponibilità intracellulare di amminoacidi, SLC43A1 influenza la segnalazione collegata a mTORC1, la sintesi proteica e l’adattamento metabolico in stati cellulari proliferativi e differenziati. Un’espressione alterata di SLC43A1 è stata riportata in contesti di riprogrammazione metabolica e di acquisizione di nutrienti associata ai tumori, nei quali l’attività del trasportatore può modellare la crescita e le risposte allo stress. Queste caratteristiche rendono SLC43A1 un nodo utile per studiare la dinamica del trasporto di amminoacidi, il crosstalk tra vie metaboliche e il controllo trascrizionale delle reti di trasportatori di nutrienti.

SLC43A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC43A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SLC43A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC43A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC43A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SLC43A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC43A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SLC43A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SLC43A1 nelle cellule tumorali con espressione di SLC43A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.