Skip CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403370-ACT

SNW1 kodiert Skip, einen konservierten nukleären Ko‑Regulator, der das Spleißen von Prä‑mRNA mit der transkriptionellen Kontrolle koppelt. Skip ist an spleißosomenassoziierten Komplexen beteiligt und koordiniert Entscheidungen zur alternativen Spleißung, die den Zellzyklusverlauf, Differenzierungsprogramme und stressresponsive Genexpression beeinflussen. Über Interaktionen mit Transkriptionsfaktoren und chromatinassoziierten Komplexen trägt Skip dazu bei, RNA‑Prozessierungsresultate zu formen, die Signalnetzwerke wie Notch und die TGF‑β/SMAD‑abhängige Transkription umgestalten können. Eine Fehlregulation der mit SNW1 verknüpften Spleiß- und Transkriptionssteuerung wurde mit veränderten Proliferationszuständen und onkogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, was SNW1 als mechanistischen Ansatzpunkt für die Untersuchung krankheitsrelevanter RNA‑Prozessierung unterstützt.

Skip Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SNW1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Skip Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SNW1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SNW1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Skip-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SNW1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Skip-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Skip-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SNW1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.