SKAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406377-ACT

Il gene umano **KNSTRN** codifica **SKAP** (small kinetochore-associated protein), un regolatore mitotico che si localizza ai cinetocori e sostiene una corretta segregazione dei cromosomi. SKAP partecipa all’aggancio tra cinetocoro e microtubuli e a processi collegati al checkpoint del fuso, contribuendo a coordinare l’allineamento in metafase e la progressione in anafase durante la mitosi. L’alterazione o la deregolazione di KNSTRN/SKAP può contribuire all’instabilità cromosomica e all’aneuploidia, fenomeni frequentemente studiati nella biologia del cancro e nella ricerca sul mantenimento del genoma. Di conseguenza, KNSTRN viene comunemente analizzato nell’ambito delle vie che regolano l’assemblaggio del fuso, la progressione del ciclo cellulare e la fedeltà mitotica.

SKAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KNSTRN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SKAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KNSTRN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KNSTRN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SKAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KNSTRN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SKAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SKAP nelle cellule tumorali con espressione di KNSTRN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.