SGTA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404399-ACT

La SGTA umana (small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing protein alpha) è un co-chaperone che si lega a HSP70/HSC70 e HSP90 per coordinare il controllo qualità delle proteine e la gestione delle proteine client. SGTA partecipa allo smistamento (triage) di polipeptidi idrofobici e di proteine di membrana a coda ancorata (tail-anchored), influenzandone l’instradamento verso le vie di inserzione in membrana oppure verso la degradazione proteasomiale, e interagisce funzionalmente con l’asse di targeting BAG6/GET. Attraverso queste interazioni, SGTA contribuisce a mantenere la proteostasi, modula la maturazione di recettori e proteine di segnalazione e influisce sulle risposte cellulari allo stress, come la degradazione associata al reticolo endoplasmatico (ERAD). La disregolazione delle reti di chaperoni che includono SGTA è stata associata ad alterazioni dell’omeostasi proteica in contesti rilevanti per la biologia del cancro e la neurodegenerazione, a supporto del suo valore come nodo meccanicistico per l’interrogazione delle vie di segnalazione.

SGTA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SGTA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SGTA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SGTA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SGTA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SGTA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SGTA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SGTA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SGTA nelle cellule tumorali con espressione di SGTA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.