SAMHD1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406002-ACT

La SAMHD1 umana (proteina 1 contenente domini SAM e HD) è una dNTP trifosfoidrolasi che regola i pool intracellulari di deossinucleotidi, influenzando così la fedeltà della replicazione del DNA, la capacità di riparazione e la stabilità del genoma. Controllando la disponibilità di dNTP, SAMHD1 si integra nelle risposte allo stress replicativo e nelle vie di segnalazione del danno al DNA, inclusi i processi che modellano la progressione del ciclo cellulare e il mantenimento dell’omeostasi dei nucleotidi. SAMHD1 limita inoltre la replicazione dei retrovirus nelle cellule mieloidi e nelle cellule T a riposo riducendo i substrati dNTP necessari alla retrotrascrizione, collegandosi alla regolazione dell’immunità innata. La deregolazione o le mutazioni di SAMHD1 sono state associate a fenotipi infiammatori e autoimmuni e sono state studiate nel contesto delle interazioni virus–ospite e dello stress replicativo associato al cancro.

SAMHD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SAMHD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SAMHD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SAMHD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SAMHD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SAMHD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SAMHD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SAMHD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SAMHD1 nelle cellule tumorali con espressione di SAMHD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.