Rev-erbα Particelle di Attivazione Lentivirale (h2): sc-401211-LAC-2

Il gene umano NR1D1 codifica il recettore nucleare Rev-erbα (NR1D1), un repressore trascrizionale legante l’eme che collega il metabolismo cellulare alla tempistica circadiana modulando l’espressione genica sugli elementi di risposta Rev-erb/ROR. Rev-erbα agisce all’interno del circuito centrale dell’orologio biologico limitando la trascrizione guidata da BMAL1/CLOCK e coordina vie che controllano il metabolismo dei lipidi e del glucosio, la funzione mitocondriale e la segnalazione infiammatoria attraverso interazioni con corepressori come NCoR/HDAC3. La disregolazione di NR1D1 è stata associata ad alterazioni della ritmicità circadiana e a fenotipi metabolici, con una rilevanza riportata per la biologia delle malattie cardiometaboliche e infiammatorie. L’editing genomico o la perturbazione di NR1D1 è quindi utile per analizzare le reti trascrizionali alla base della regolazione circadiana, dell’omeostasi metabolica e del crosstalk immuno-metabolico in modelli cellulari umani.

Le particelle di attivazione lentivirale Rev-erbα (h2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di NR1D1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Rev-erbα (h2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione NR1D1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Rev-erbα. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo NR1D1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.