RBM35A Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-405645-ACT-2

L’ESRP1 umano (epithelial splicing regulatory protein 1; RBM35A) codifica un fattore di splicing legante l’RNA che riconosce motivi ricchi in GU per controllare programmi di splicing alternativo caratteristici delle cellule epiteliali. ESRP1 contribuisce a mantenere l’identità epiteliale coordinando la selezione delle isoforme in trascritti coinvolti nell’adesione cellula-cellula, nell’organizzazione del citoscheletro, nella polarità e nelle reti di segnalazione legate alla transizione epitelio-mesenchimale (EMT), comprese vie che intersecano la regolazione delle isoforme di FGFR e CD44. Uno splicing mediato da ESRP1 deregolato è stato associato ad alterazioni degli stati EMT e a fenotipi di progressione tumorale in molteplici tumori di origine epiteliale, suggerendo che ESRP1 rappresenti un nodo chiave nei cambiamenti di processamento dell’RNA osservati durante il rimodellamento associato alla metastasi. L’editing genetico di ESRP1 consente studi meccanicistici della regolazione dipendente dallo splicing, analisi trascrittomiche con risoluzione di isoforma e l’interrogazione funzionale dei programmi di EMT e di differenziazione epiteliale in modelli cellulari umani.

RBM35A Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ESRP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RBM35A Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ESRP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ESRP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RBM35A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ESRP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RBM35A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RBM35A nelle cellule tumorali con espressione di ESRP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.