Rab 32 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403733-ACT

RAB32 codifica Rab32, una piccola GTPasi della famiglia RAB che regola il traffico intracellulare di membrane, incluso il trasporto tra endosomi, organelli correlati ai lisosomi e compartimenti associati ai mitocondri. Rab32 partecipa alla gemmazione delle vescicole, allo smistamento del carico e all’omeostasi degli organelli, collegando il traffico dipendente da Rab alla dinamica mitocondriale e alle risposte cellulari allo stress. Attraverso il suo ruolo nel traffico e nel controllo qualità degli organelli, un’alterata attività di RAB32 è stata associata, in contesti rilevanti per la malattia, a infiammazione deregolata e a un metabolismo cellulare aberrante. Queste funzioni rendono RAB32 un nodo utile per studiare le vie di trasporto vescicolare, la biogenesi degli organelli e le reti di segnalazione che dipendono dalla localizzazione compartimentalizzata delle proteine.

Rab 32 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB32 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 32 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB32 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB32, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 32. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB32 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 32 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 32 nelle cellule tumorali con espressione di RAB32 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.