Rab 14 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402109-ACT

RAB14 codifica Rab14, una piccola GTPasi della superfamiglia RAS che coordina il traffico di membrana alternando ciclicamente gli stati legati a GDP e a GTP, così da controllare la gemmazione, il trasporto e la fusione delle vescicole. Rab14 regola il riciclo endocitico e il trasporto biosintetico tra la rete trans-Golgi, gli endosomi precoci/di riciclo e la membrana plasmatica, influenzando lo smistamento del carico, il turnover dei recettori e il traffico polarizzato. Attraverso questi processi, RAB14 contribuisce al mantenimento della polarità cellulare, alla distribuzione dei trasportatori di nutrienti e alla dinamica della trasduzione del segnale. Alterazioni del traffico regolato da Rab14 sono state collegate in letteratura a programmi di proliferazione e migrazione deregolati osservati in molteplici contesti patologici, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici di fenotipi dipendenti dal trasporto vescicolare.

Rab 14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 14. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 14 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 14 nelle cellule tumorali con espressione di RAB14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.