R2 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-400624-LAC

RRM2 umano codifica la piccola subunità R2 della ribonucleotide reduttasi, un enzima essenziale che converte i ribonucleotidi in desossiribonucleotidi per sostenere la sintesi e la riparazione del DNA. R2 fornisce un centro generatore di radicali che consente l’attività catalitica insieme alla subunità R1, collegando l’abbondanza di RRM2 alla progressione della fase S, alla stabilità delle forcelle di replicazione e al mantenimento del genoma. L’espressione di RRM2 è regolata da reti di segnalazione del ciclo cellulare e del danno al DNA, inclusi il controllo dei checkpoint e le risposte allo stress replicativo che modulano l’omeostasi dei pool di dNTP. Un’attività deregolata di RRM2 è spesso studiata nel contesto di programmi proliferativi, capacità di riparazione del DNA e meccanismi di resistenza allo stress genotossico nella biologia dei tumori.

Le particelle di attivazione lentivirale R2 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di RRM2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale R2 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione RRM2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di R2. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo RRM2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.