QIP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405442-ACT

KPNA4 codifica la subunità alfa 4 della carioferina, nota anche come QIP1, un adattatore per l’importazione nucleare che si lega ai classici segnali di localizzazione nucleare e, in collaborazione con importina beta, trasporta le proteine cargo attraverso il complesso del poro nucleare. Regolando il trasporto nucleo‑citoplasmatico, KPNA4 influenza programmi trascrizionali, controllo del ciclo cellulare, risposte allo stress e vie di segnalazione che dipendono dall’ingresso tempestivo nel nucleo di fattori di trascrizione ed enzimi regolatori. Un’alterata attività della famiglia delle importine‑α è stata associata a un’espressione genica disregolata e a segnali di crescita aberranti, rendendo KPNA4/QIP1 rilevante per studi sulla segnalazione oncogenica, sulle interazioni virus‑ospite e sulla neurobiologia, in cui la capacità di trasporto nucleare può essere un fattore limitante. La mappatura dei cargo dipendenti da KPNA4 e della dinamica di trasporto è quindi utile per analizzare la connettività delle vie e i requisiti di importazione nucleare specifici del contesto nelle cellule umane.

QIP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KPNA4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

QIP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KPNA4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KPNA4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di QIP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KPNA4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da QIP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via QIP1 nelle cellule tumorali con espressione di KPNA4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.