PTPLAD2 Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-417162-ACT-2

HACD4 umano (che codifica PTPLAD2) è una presunta enzima simile a una 3-idrossiacil-CoA deidratasi, implicata nell’allungamento degli acidi grassi a catena molto lunga (VLCFA), collegandola all’omeostasi del metabolismo lipidico, alla biogenesi delle membrane e a processi associati al reticolo endoplasmatico. Attraverso il suo ruolo previsto nel rimodellamento degli acidi grassi, HACD4/PTPLAD2 è rilevante per le vie che regolano la composizione dei fosfolipidi, l’integrità degli organelli e le risposte cellulari allo stress che influenzano proliferazione e differenziamento. Un’alterata regolazione delle reti di allungamento lipidico e firme molecolari associate a PTPLAD2 sono state riportate in contesti di disfunzione metabolica e di biologia correlata al cancro, a supporto della sua utilità come nodo meccanicistico per lo studio di fenotipi guidati dai lipidi. L’editing genetico di HACD4 consente la dissezione funzionale del metabolismo dei VLCFA, l’analisi della segnalazione a valle e degli adattamenti trascrittomici, nonché lo sviluppo di modelli cellulari per ricerche su lipidomica, stress del reticolo endoplasmatico e dinamiche di membrana.

PTPLAD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HACD4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PTPLAD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HACD4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HACD4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PTPLAD2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HACD4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PTPLAD2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PTPLAD2 nelle cellule tumorali con espressione di HACD4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.