PPP2R3A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402433-ACT

PPP2R3A codifica una subunità regolatoria B″/PR72 della proteina fosfatasi 2A (PP2A), una delle principali fosfatasi serina/treonina che modella la segnalazione fosforilativa indirizzando il riconoscimento dei substrati e il targeting subcellulare dell’olenzima PP2A. Attraverso il controllo, dipendente da PP2A, dell’equilibrio tra chinasi e fosfatasi, PPP2R3A è coinvolto nel coordinamento della progressione del ciclo cellulare, delle risposte al danno al DNA e di programmi più ampi di trasduzione del segnale che influenzano il metabolismo e l’adattamento allo stress. Un’alterazione della composizione delle subunità regolatorie di PP2A è spesso associata a reti di fosforilazione deregolate osservate in patologie proliferative e neurobiologiche, rendendo PPP2R3A rilevante per analizzare il rimodellamento delle vie di segnalazione. Modulando l’espressione di PPP2R3A è quindi possibile studiare, in modelli cellulari umani, la regolazione mediata da fosfatasi di nodi di crescita e di segnalazione.

PPP2R3A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP2R3A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PPP2R3A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP2R3A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP2R3A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PPP2R3A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP2R3A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PPP2R3A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PPP2R3A nelle cellule tumorali con espressione di PPP2R3A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.