PPP1R12C Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-412332-LAC

PPP1R12C codifica la subunità 3 di indirizzamento della fosfatasi della miosina (MYPT3), una componente regolatoria della proteina fosfatasi 1 che contribuisce a dirigere l’attività catalitica di PP1 verso substrati del citoscheletro. Controllando gli stati di fosforilazione della catena leggera della miosina e di altri regolatori correlati dell’actomiosina, PPP1R12C contribuisce alla contrattilità cellulare, alla dinamica dell’adesione e alla motilità, integrando input di segnalazione da RhoA/ROCK e da altre vie mediate da chinasi. Un’alterata direzionalità di PP1 e la funzione della fosfatasi della miosina possono perturbare il rimodellamento del citoscheletro e la meccanotrasduzione, processi frequentemente implicati nell’invasione delle cellule tumorali, nel rimodellamento associato alla fibrosi e nella disfunzione della muscolatura liscia vascolare. L’espressione di PPP1R12C e la sua regolazione dipendente dalla fosforilazione sono quindi rilevanti per studi sull’organizzazione delle fibre di stress, sul controllo della forma cellulare e sul crosstalk di segnalazione che modula fenotipi contrattili.

Le particelle di attivazione lentivirale PPP1R12C (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di PPP1R12C in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale PPP1R12C (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione PPP1R12C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di PPP1R12C. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo PPP1R12C e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.