Positive cofactor 4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403272-ACT

SUB1 umano codifica il Cofattore positivo 4 (PC4), un coattivatore trascrizionale legante il DNA che modula la trascrizione mediata dall’RNA polimerasi II stabilizzando i complessi di pre-inizio e coordinando l’espressione genica dipendente dagli attivatori. PC4 partecipa anche al mantenimento del genoma influenzando le risposte al danno al DNA e le dinamiche della cromatina associate alla riparazione, collegando il controllo trascrizionale allo stress replicativo e ai programmi cellulari di recupero. Attraverso queste funzioni, SUB1/PC4 è stato studiato in vie che regolano la progressione del ciclo cellulare, la trascrizione in risposta allo stress e l’equilibrio tra trascrizione e riparazione del DNA. Un’attività di PC4 deregolata e profili di espressione alterati di SUB1 sono stati riportati in molteplici contesti rilevanti per la malattia, a sostegno della sua utilità come nodo meccanicistico per analizzare la stabilità del genoma accoppiata alla trascrizione.

Positive cofactor 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SUB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Positive cofactor 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SUB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SUB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Positive cofactor 4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SUB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Positive cofactor 4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Positive cofactor 4 nelle cellule tumorali con espressione di SUB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.