PORCN Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-413044-ACT

Il PORCN umano codifica una O-aciltransferasi di membrana localizzata nel reticolo endoplasmatico che catalizza la palmitoleoilazione dei ligandi WNT, una modifica necessaria per la secrezione dei WNT, la formazione di gradienti extracellulari e l’interazione con i recettori. Attraverso questo passaggio di processamento essenziale, PORCN regola la segnalazione WNT canonica e non canonica, influenzando la trascrizione dipendente da β-catenina, la specificazione del destino cellulare, la proliferazione e il patterning tissutale. Un’alterazione dell’output WNT dipendente da PORCN è implicata in anomalie dello sviluppo e in patologie caratterizzate da un’attività disregolata della via WNT, a supporto del suo impiego in studi meccanicistici dei programmi di differenziamento e del rimodellamento delle reti di segnalazione. La funzione di PORCN è inoltre rilevante per studi sull’omeostasi epiteliale, la biologia delle cellule staminali e il crosstalk tra vie che influisce sulla morfogenesi e su stati di segnalazione oncogenici.

PORCN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PORCN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PORCN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PORCN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PORCN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PORCN. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PORCN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PORCN nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PORCN nelle cellule tumorali con espressione di PORCN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.