POLR1E Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407602-ACT

POLR1E codifica una subunità centrale della RNA polimerasi I, un complesso multiproteico responsabile della trascrizione dei precursori dell’RNA ribosomiale che avviano la biogenesi dei ribosomi nel nucleolo. Sostenendo la sintesi e il processamento del pre-rRNA, POLR1E contribuisce al controllo della crescita cellulare, alla capacità di proteostasi e alle vie di segnalazione dello stress nucleolare che collegano la produzione di ribosomi alla regolazione del ciclo cellulare. Alterazioni della funzione della RNA polimerasi I possono compromettere l’omeostasi della sintesi proteica e attivare risposte di stress come i checkpoint associati a p53, rendendo POLR1E rilevante per studi su proliferazione, differenziamento e stabilità del genoma. Evidenze genetiche collegano la disfunzione di POLR1E a fenotipi di ribosomopatie umane e a disturbi dello sviluppo, sottolineandone l’importanza nei tessuti con elevata richiesta biosintetica.

POLR1E Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POLR1E senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

POLR1E Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POLR1E nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POLR1E, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di POLR1E. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POLR1E nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da POLR1E nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via POLR1E nelle cellule tumorali con espressione di POLR1E silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.