PLC γ1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400472-ACT

PLCG1 codifica la fosfolipasi C gamma 1 (PLCγ1), un enzima di segnalazione prossimale al recettore attivato a valle delle tirosin-chinasi recettoriali e dei recettori immunitari. Una volta attivata, PLCγ1 idrolizza il PIP2 generando IP3 e DAG, innescando la mobilizzazione del Ca2+ intracellulare e l’attivazione della PKC, che coordinano programmi trascrizionali, rimodellamento del citoscheletro e migrazione cellulare. Questo nodo di segnalazione integra input da vie quali EGFR/PDGFR/FGFR e la segnalazione del recettore delle cellule T, modulando risposte di proliferazione e differenziamento. Un’attività deregolata di PLCG1 e il “rewiring” delle vie di segnalazione sono stati associati a una segnalazione aberrante dei fattori di crescita e a patologie immuno-correlate, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici della trasduzione del segnale guidata dai fosfoinositidi.

PLC γ1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PLCG1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PLC γ1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PLCG1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PLCG1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PLC γ1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PLCG1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PLC γ1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PLC γ1 nelle cellule tumorali con espressione di PLCG1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.