PKC lambda/iota Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402111-ACT

PRKCI codifica l’isoforma atipica della protein chinasi C PKC lambda/iota, una chinasi serina/treonina che opera all’interno di complessi di polarità e di segnalazione per regolare l’organizzazione epiteliale, la divisione cellulare asimmetrica e la dinamica del citoscheletro. Agendo a valle di input provenienti da fosfoinositidi e piccole GTPasi, PRKCI partecipa alla segnalazione di polarità Par3–Par6 e si interfaccia con vie che controllano la sopravvivenza cellulare, la migrazione e l’integrità delle giunzioni. Un’attività o un’espressione deregolata di PRKCI è stata associata ad alterazioni dei programmi di polarità e della segnalazione proliferativa in molteplici contesti patologici, incluse manifestazioni correlate al cancro come invasione e resistenza ai segnali apoptotici. Queste caratteristiche rendono PRKCI un bersaglio utile per studi meccanicistici della segnalazione dipendente dalla polarità, delle risposte allo stress e delle transizioni di stato cellulare.

PKC lambda/iota Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRKCI senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PKC lambda/iota Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRKCI nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRKCI, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PKC lambda/iota. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRKCI nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PKC lambda/iota nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PKC lambda/iota nelle cellule tumorali con espressione di PRKCI silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.