PKC delta Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400287-ACT

PRKCD codifica la proteina chinasi C delta (PKCδ), una chinasi serina/treonina responsiva al diacilglicerolo che collega i segnali indotti dai recettori a programmi di fosforilazione a valle che controllano proliferazione, differenziamento, apoptosi e rimodellamento del citoscheletro. PKCδ partecipa al crosstalk tra le vie PKC/MAPK e PI3K–AKT, modula la segnalazione infiammatoria dipendente da NF-κB e regola le risposte al danno al DNA tramite la fosforilazione di effettori dello stress e dei checkpoint. Nelle cellule immunitarie ed ematopoietiche, PRKCD contribuisce a modulare la segnalazione del recettore delle cellule B e la tolleranza, mentre nei contesti epiteliali influenza l’adesione e il comportamento migratorio. Un’attività o un’espressione deregolata di PRKCD è stata associata a soglie apoptotiche alterate, fenotipi infiammatori e rimodulazione oncogenica della segnalazione, rendendolo un nodo rilevante per studi meccanicistici incentrati sulle vie di segnalazione.

PKC delta Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRKCD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PKC delta Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRKCD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRKCD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PKC delta. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRKCD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PKC delta nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PKC delta nelle cellule tumorali con espressione di PRKCD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.