PH-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409966-ACT

Il gene umano **P4HTM** codifica **PH-4**, una proliil 4-idrossilasi associata al reticolo endoplasmatico che catalizza l’idrossilazione dei residui di prolina su substrati proteici, una modifica post-traduzionale in grado di influenzare il ripiegamento, la stabilità e la secrezione delle proteine. Come parte della più ampia rete delle proliil idrossilasi, PH-4 collega un’attività enzimatica dipendente dall’ossigeno e dai metaboliti ai processi di proteostasi e alle vie di adattamento cellulare. Una chimica di idrossilazione e una gestione nel RE deregolate sono state associate ad alterazioni della segnalazione da stress e a fenotipi metabolici, alimentando l’interesse verso P4HTM come nodo di connessione tra stato redox, controllo qualità proteico e regolazione dello stato cellulare. La variazione genetica e i cambiamenti di espressione di P4HTM sono stati indagati in contesti che coinvolgono tratti metabolici e neuro-sviluppativi, motivando studi meccanicistici in modelli cellulari umani pertinenti.

PH-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di P4HTM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PH-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus P4HTM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione P4HTM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PH-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus P4HTM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PH-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PH-4 nelle cellule tumorali con espressione di P4HTM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.