PFKL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402662-ACT

PFKL codifica l’isoforma epatica della fosfofruttochinasi-1, un enzima limitante della velocità che catalizza la conversione del fruttosio-6-fosfato in fruttosio-1,6-bisfosfato, impegnando il glucosio nella glicolisi. In quanto snodo chiave di controllo metabolico, PFKL integra la regolazione allosterica mediata da ATP, AMP, citrato e fruttosio-2,6-bisfosfato per modulare il flusso glicolitico e il successivo convogliamento del carbonio nel ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) e nelle vie biosintetiche. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di PFKL contribuiscono alla riprogrammazione metabolica, influenzando la proliferazione cellulare, l’equilibrio redox e le risposte di sensing dei nutrienti. Una glicolisi deregolata che coinvolge PFKL è stata associata al metabolismo tumorale e ad altri disturbi caratterizzati da un’omeostasi energetica perturbata, a supporto del suo impiego in studi meccanicistici di fenotipi guidati dal metabolismo.

PFKL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PFKL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PFKL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PFKL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PFKL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PFKL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PFKL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PFKL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PFKL nelle cellule tumorali con espressione di PFKL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.