Peroxin 14 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405075-ACT

PEX14 codifica la perossina 14, un componente essenziale della macchina di importazione perossisomiale che ancora i complessi recettoriali PEX5/PEX7 alla membrana del perossisoma per consentire la traslocazione degli enzimi della matrice. Attraverso il suo ruolo nella biogenesi del perossisoma e nell’importazione proteica, PEX14 supporta la β‑ossidazione degli acidi grassi, la sintesi dei lipidi etere e la detossificazione delle specie reattive dell’ossigeno, collegandosi così all’equilibrio redox cellulare e all’omeostasi lipidica. Alterazioni dell’importazione e della biogenesi perossisomiale sono associate ai disordini della biogenesi dei perossisomi e a fenotipi metabolici e del neurosviluppo più ampi, rendendo la regolazione di PEX14 rilevante per studi meccanicistici della disfunzione degli organelli. Nei modelli cellulari umani, la modulazione di PEX14 offre un punto d’ingresso gestibile per indagare le vie dipendenti dai perossisomi e la loro interazione con la segnalazione mitocondriale e infiammatoria.

Peroxin 14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PEX14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Peroxin 14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PEX14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PEX14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Peroxin 14. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PEX14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Peroxin 14 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Peroxin 14 nelle cellule tumorali con espressione di PEX14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.