Peripherin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401335-ACT

PRPH codifica la periferina, una proteina dei filamenti intermedi di tipo III, arricchita nei neuroni periferici e coinvolta nell’architettura del citoscheletro e nell’integrità assonale. La periferina partecipa all’assemblaggio e al rimodellamento dei filamenti intermedi, supportando l’estensione dei neuriti, il trasporto assonale e le risposte allo stress cellulare durante la differenziazione e la rigenerazione neuronale. La sua espressione è comunemente utilizzata come marcatore dello sviluppo del sistema nervoso periferico e della riprogrammazione associata al danno. Un’espressione deregolata di PRPH e un’alterata organizzazione dei filamenti sono state collegate a processi neurodegenerativi e alla vulnerabilità dei motoneuroni, confermandone la rilevanza negli studi meccanicistici della disfunzione neuronale.

Peripherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRPH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Peripherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRPH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRPH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Peripherin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRPH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Peripherin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Peripherin nelle cellule tumorali con espressione di PRPH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.