PAR-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401719-ACT

F2RL3 codifica il recettore attivato da proteasi 4 (PAR-4), un recettore accoppiato a proteine G attivato dalla trombina e da altre proteasi sieriniche tramite lo smascheramento proteolitico di un ligando “tethered” (ancorato). La segnalazione di PAR-4 coinvolge le vie Gq e G12/13 per stimolare l’attività della fosfolipasi C, la mobilizzazione del Ca2+ intracellulare, la segnalazione RhoA/ROCK e, a valle, i programmi trascrizionali mediati da MAPK e NF-κB. Nelle piastrine e nelle cellule associate al comparto vascolare, queste cascate regolano l’attivazione, la secrezione, il rimodellamento del citoscheletro e il crosstalk infiammatorio. Un’attività deregolata di PAR-4 e specifici pattern di espressione di F2RL3 sono stati associati a processi biologici rilevanti per la trombosi, all’infiammazione vascolare e alla segnalazione del microambiente correlata al cancro, a supporto di studi meccanicistici che spaziano dall’emostasi alle interazioni tumore–stroma.

PAR-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di F2RL3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PAR-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus F2RL3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione F2RL3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PAR-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus F2RL3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PAR-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PAR-4 nelle cellule tumorali con espressione di F2RL3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.