PAK5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404073-ACT

PAK5 (p21-activated kinase 5; PAK7) è una chinasi serina/treonina ed effettore a valle delle GTPasi della famiglia Rho, come CDC42 e RAC1, che regola il rimodellamento del citoscheletro, la polarità cellulare e la segnalazione di sopravvivenza. Nelle cellule umane, PAK5 influenza la dinamica dell’actina e la stabilità dei microtubuli, modellando processi quali la crescita dei neuriti, la migrazione e il traffico vescicolare. Interagisce con le reti associate a MAPK/ERK e PI3K/AKT e può modulare la fosforilazione di substrati che coordinano adesione e motilità. Un’alterazione dell’espressione o della segnalazione di PAK5 è stata riportata in molteplici contesti tumorali ed è rilevante anche per la neurobiologia, grazie ai suoi ruoli nello sviluppo neuronale e nella funzione sinaptica.

PAK5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PAK5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PAK5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PAK5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PAK5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PAK5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PAK5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PAK5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PAK5 nelle cellule tumorali con espressione di PAK5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.