ORMDL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403586-ACT

ORMDL1 (orosomucoid-like 1) è una proteina di membrana residente nel reticolo endoplasmatico che funge da regolatore conservato dell’omeostasi degli sfingolipidi attraverso l’inibizione della serina palmitoiltransferasi, l’enzima limitante la velocità nella sintesi de novo della ceramide. Modulando i pool di ceramide e sfingomielina, ORMDL1 influenza la composizione di membrana, le risposte allo stress del RE e i processi di segnalazione a valle legati alla crescita cellulare e alle vie infiammatorie. Un metabolismo degli sfingolipidi deregolato e lo stress del RE sono stati implicati in fenotipi cardiometabolici e immuno-correlati, rendendo ORMDL1 un nodo rilevante per studi meccanicistici della segnalazione guidata dai lipidi. In ambito di biologia del cancro e di adattamento allo stress, un’espressione alterata di ORMDL1 è stata associata, in modo dipendente dal tipo cellulare, a cambiamenti nei programmi di proliferazione, migrazione e sopravvivenza.

ORMDL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ORMDL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ORMDL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ORMDL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ORMDL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ORMDL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ORMDL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ORMDL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ORMDL1 nelle cellule tumorali con espressione di ORMDL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.