Plasmide CRISPR d'Activation (m) Oct3/4: sc-422357-ACT

Pou5f1 code le facteur de transcription à domaine POU Oct3/4 chez la souris, un régulateur maître de la pluripotence et des décisions précoces de lignage embryonnaire. Oct3/4 coordonne des programmes transcriptionnels avec des facteurs centraux de la « stemness » tels que Sox2 et Nanog afin de maintenir l’auto-renouvellement et de réprimer la différenciation, en intégrant des signaux issus de voies incluant LIF/STAT3, WNT/β-caténine et TGF-β/SMAD. Une expression altérée d’Oct3/4 est associée à des trajectoires développementales perturbées et est fréquemment utilisée comme marqueur moléculaire d’états de type « cellules souches » en biologie du cancer, où des réseaux de pluripotence dérégulés peuvent contribuer à l’hétérogénéité tumorale. En conséquence, Pou5f1/Oct3/4 occupe une place centrale dans les études de reprogrammation, de régulation épigénétique et de stabilité du destin cellulaire dans des systèmes modèles murins.

Oct3/4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Pou5f1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Oct3/4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Pou5f1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Pou5f1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Oct3/4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Pou5f1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Oct3/4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Oct3/4 dans les cellules tumorales présentant une expression de Pou5f1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.