OAZ Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-430124-ACT

Nel topo, Zfp423 codifica il regolatore trascrizionale multi–zinc finger OAZ, una proteina legante il DNA che integra segnali di sviluppo per controllare la specificazione di linea e i programmi di differenziamento. OAZ partecipa a reti trascrizionali legate alla segnalazione BMP/SMAD e interagisce con cofattori che modulano l’espressione genica neuronale e adipocitaria, influenzando le decisioni di destino cellulare e la maturazione. Nel sistema nervoso, Zfp423 è implicato nello sviluppo del cervelletto e nel patterning neuronale, mentre nei tessuti metabolici contribuisce all’adipogenesi e all’omeostasi energetica. La deregolazione dei programmi trascrizionali associati a Zfp423 è quindi rilevante in modelli di difetti del neurosviluppo e di fenotipi metabolici, in cui alterazioni del differenziamento e del cross-talk tra vie di segnalazione rappresentano meccanismi chiave.

OAZ Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Zfp423 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OAZ Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Zfp423 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Zfp423, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OAZ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Zfp423 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OAZ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OAZ nelle cellule tumorali con espressione di Zfp423 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.