NT-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402291-ACT

Il gene umano NTF4 codifica la neurotrofina-4 (NT-4), un fattore di crescita secreto che segnala principalmente attraverso NTRK2/TrkB e, con minore affinità, attraverso NGFR/p75NTR, per regolare la sopravvivenza neuronale, la differenziazione e il mantenimento sinaptico. L’interazione NT-4–TrkB attiva a valle le vie di segnalazione PI3K–AKT, MAPK/ERK e PLCγ, sostenendo l’estensione dei neuriti e la plasticità dipendente dall’attività nel sistema nervoso centrale e periferico. Oltre alla neurobiologia, l’espressione di NTF4 e l’attività della via di TrkB influenzano le risposte allo stress cellulare e programmi di supporto trofico che si intrecciano con processi degenerativi e rimodellamento maladattivo. La deregolazione della segnalazione neurotrofine/TrkB è stata studiata in contesti che includono processi neurodegenerativi, meccanismi del dolore neuropatico e interazioni tra cellule tumorali e microambiente, in cui la disponibilità di fattori di crescita può modulare fenotipi di proliferazione e sopravvivenza.

NT-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NTF4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NT-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NTF4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NTF4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NT-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NTF4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NT-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NT-4 nelle cellule tumorali con espressione di NTF4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.