Nkx-2.2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401844-ACT

NKX2-2 codifica il fattore di trascrizione homeobox Nkx-2.2, un regolatore nucleare che contribuisce a specificare il destino cellulare e a mantenere programmi trascrizionali ristretti alla linea durante lo sviluppo. È stato caratterizzato soprattutto nel sistema nervoso centrale e nei compartimenti endocrini del pancreas, dove coordina differenziazione e maturazione integrandosi con reti di homeodomini e con il controllo epigenetico dell’espressione genica. L’attività di NKX2-2 influenza i processi di patterning dello sviluppo e i circuiti regolatori genici a valle che modellano l’impegno dei progenitori, la proliferazione e la differenziazione terminale. Un’espressione deregolata di NKX2-2 è stata riportata in diversi contesti patologici associati a stati di differenziazione alterati e a programmi trascrizionali aberranti, rendendolo un nodo utile per studiare i circuiti trascrizionali dello sviluppo e oncogenici.

Nkx-2.2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NKX2-2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nkx-2.2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NKX2-2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NKX2-2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nkx-2.2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NKX2-2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nkx-2.2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nkx-2.2 nelle cellule tumorali con espressione di NKX2-2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.