NKp30 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403117-ACT

NCR3 codifica NKp30, un recettore attivante espresso sulle cellule natural killer (NK) e su sottopopolazioni di cellule T di tipo innato, che contribuisce alla sorveglianza immunitaria tramite il riconoscimento di ligandi indotti dallo stress sulle cellule bersaglio. L’ingaggio di NKp30 innesca una segnalazione dipendente da ITAM attraverso molecole adattatrici associate, promuovendo vie a valle quali l’attivazione di SYK/ZAP70, il flusso di calcio, la segnalazione MAPK, l’esocitosi dei granuli citotossici e la produzione di citochine. Alterazioni dell’espressione o della funzione di NCR3/NKp30 sono state collegate a differenze nella responsività delle cellule NK nei microambienti tumorali e durante l’infezione virale, e vengono frequentemente studiate nel contesto dell’evasione immunitaria e dell’infiammazione. In quanto recettore di superficie centrale per l’attivazione degli effettori innati, NKp30 rappresenta un nodo sperimentale gestibile per analizzare le soglie di segnalazione e la biologia recettore–ligando nelle cellule immunitarie umane.

NKp30 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NCR3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NKp30 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NCR3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NCR3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NKp30. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NCR3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NKp30 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NKp30 nelle cellule tumorali con espressione di NCR3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.