NK-1R Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401004-ACT

TACR1 codifica il recettore umano della neurochinina-1 (NK-1R), un GPCR di classe A che lega il neuropeptide tachichininico sostanza P e si accoppia principalmente alla segnalazione mediata da Gq/11. L’attivazione di NK-1R promuove la mobilizzazione di inositolo fosfati e calcio dipendente dalla fosfolipasi C, con il successivo coinvolgimento di PKC, MAPK/ERK e programmi trascrizionali che modulano l’eccitabilità neuronale, l’infiammazione neurogena e la contrattilità della muscolatura liscia. TACR1 è espresso nel sistema nervoso centrale e periferico, oltre che in compartimenti immunitari ed epiteliali, collegando la comunicazione neuro-immune alle risposte di barriera e vascolari. Alterazioni della segnalazione TACR1/NK-1R sono state associate a processi infiammatori e al dolore, a disfunzioni delle vie aeree e del tratto gastrointestinale e a cambiamenti dipendenti dal contesto nella segnalazione del microambiente tumorale, a supporto di studi meccanicistici in modelli cellulari rilevanti per la malattia.

NK-1R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TACR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NK-1R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TACR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TACR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NK-1R. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TACR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NK-1R nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NK-1R nelle cellule tumorali con espressione di TACR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.