NIF-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412963-ACT

ZNF335 umano codifica NIF-1, una proteina nucleare a dita di zinco che agisce come regolatore della trascrizione associato alla cromatina e dei programmi di espressione genica su scala genomica. NIF-1 è stato collegato al controllo della proliferazione e della differenziazione dei progenitori neurali attraverso il coordinamento di reti epigenetiche e trascrizionali che modellano insiemi di geni dello sviluppo. Influenzando lo stato della cromatina e l’attività dei promotori, ZNF335/NIF-1 si inserisce nelle vie che regolano la progressione del ciclo cellulare, la specificazione di linea e il mantenimento dell’identità cellulare. Un’espressione o una funzione alterata di ZNF335 è stata associata ad anomalie del neurosviluppo e offre un punto d’ingresso meccanicistico per studiare il controllo trascrizionale in modelli rilevanti per la malattia.

NIF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZNF335 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NIF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZNF335 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZNF335, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NIF-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZNF335 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NIF-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NIF-1 nelle cellule tumorali con espressione di ZNF335 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.