NGAL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401838-ACT

LCN2 codifica la lipocalina associata alla gelatinasi dei neutrofili (NGAL), una lipocalina secreta che lega complessi sideroforo–ferro e modula il traffico del ferro, la difesa antimicrobica e le risposte allo stress epiteliale. NGAL partecipa alla segnalazione dell’immunità innata e ai programmi infiammatori, inclusa l’interazione con vie guidate da NF-κB e dalle citochine, ed è frequentemente indotta da danno tissutale e stress cellulare. Nella biologia umana, un’alterata espressione di LCN2/NGAL è stata associata a infiammazione disregolata, rimodellamento metabolico e cambiamenti del microambiente associato al tumore, rendendola un utile marcatore e un nodo meccanicistico per lo studio delle interazioni immunità–epitelio. I suoi ruoli nella dinamica della matrice extracellulare e in processi associati alle proteasi collegano ulteriormente NGAL a contesti quali la disfunzione di barriera e fenotipi di rimodellamento.

NGAL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LCN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NGAL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LCN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LCN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NGAL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LCN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NGAL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NGAL nelle cellule tumorali con espressione di LCN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.