NF-L Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402254-ACT

NEFL codifica la proteina della catena leggera dei neurofilamenti (NF-L), un componente centrale dei filamenti intermedi che si assembla con altre subunità dei neurofilamenti per mantenere il calibro assonale, la stabilità meccanica e un trasporto efficiente a lunga distanza nei neuroni. Le dinamiche di NF-L sono collegate al rimodellamento del citoscheletro, alla guida assonale e a un’organizzazione dei filamenti dipendente dalla fosforilazione che sostiene l’integrità neuronale e la connettività sinaptica. Un’alterata espressione di NEFL o la perturbazione della rete dei neurofilamenti è associata a neurodegenerazione e neuropatie periferiche, e l’abbondanza di NF-L è ampiamente utilizzata nella ricerca come indicatore di danno neuronale e degenerazione assonale nei sistemi modello. Queste proprietà rendono NEFL un bersaglio rilevante per studiare la regolazione del citoscheletro, le vie di mantenimento dell’assone e i meccanismi che influenzano la resilienza neuronale.

NF-L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NEFL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NF-L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NEFL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NEFL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NF-L. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NEFL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NF-L nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NF-L nelle cellule tumorali con espressione di NEFL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.