NCAM-L1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401012-ACT

L1CAM codifica per NCAM-L1 (L1), una molecola di adesione cellulare neuronale che media interazioni omofiliche ed eterofiliche per regolare la crescita dei neuriti, la guida assonale, la migrazione neuronale e la plasticità sinaptica. Attraverso l’accoppiamento con adattatori del citoscheletro e nodi di segnalazione, NCAM-L1 influenza vie che controllano la dinamica dell’adesione, la motilità del cono di crescita e processi collegati a MAPK/ERK e PI3K che modellano lo sviluppo dei circuiti neurali. Nel sistema nervoso, un’espressione o una funzione alterata di L1CAM è associata a fenotipi di neuro-sviluppo ed è stata riportata anche in contesti di motilità delle cellule tumorali e comportamento invasivo, a sostegno della sua utilità per studi meccanicistici della segnalazione dipendente dall’adesione. Queste proprietà rendono L1CAM un bersaglio utile per analizzare i programmi di interazione cellula-cellula e i relativi effetti a valle su trascrizione e morfologia.

NCAM-L1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di L1CAM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NCAM-L1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus L1CAM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione L1CAM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NCAM-L1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus L1CAM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NCAM-L1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NCAM-L1 nelle cellule tumorali con espressione di L1CAM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.