MRGX2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-414107-ACT

MRGPRX2 codifica il recettore umano Mas-related accoppiato a proteine G X2 (MRGX2), un GPCR fortemente arricchito nei mastociti che media un’attivazione indipendente da IgE in risposta a diversi peptidi cationici e piccole molecole. Il legame del recettore innesca la segnalazione Gαq/PLC, la mobilizzazione del Ca2+ intracellulare e, a valle, programmi trascrizionali associati a MAPK e NF-κB che modulano la degranulazione e il rilascio di mediatori proinfiammatori. MRGX2 è stato implicato nella comunicazione neuro-immune e nelle reazioni pseudo-allergiche, e la sua disregolazione viene studiata nel contesto dell’orticaria cronica, dell’infiammazione atopica e di risposte immediate simili all’ipersensibilità indotte da farmaci. Queste proprietà rendono MRGPRX2 un nodo utile per analizzare le soglie di attivazione dei mastociti, la segnalazione “biased” del recettore e il crosstalk tra vie infiammatorie.

MRGX2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MRGPRX2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MRGX2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MRGPRX2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MRGPRX2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MRGX2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MRGPRX2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MRGX2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MRGX2 nelle cellule tumorali con espressione di MRGPRX2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.