MEK Kinase-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404345-ACT

Il gene umano MAP3K4 codifica per MEK chinasi-4 (nota anche come MTK1), una MAP chinasi chinasi chinasi che agisce a monte delle cascate MAPK JNK e p38. In quanto nodo di segnalazione responsivo a stress e citochine, MEK chinasi-4 contribuisce a collegare segnali ambientali e dello sviluppo a programmi trascrizionali che controllano apoptosi, differenziamento e risposte infiammatorie. L’attività di MAP3K4 contribuisce alla regolazione del cross-talk mediato da MAPK con la segnalazione del danno al DNA e con l’adattamento cellulare allo stress, processi frequentemente alterati nella biologia dei tumori e nella disregolazione immunitaria. La disregolazione della segnalazione MAP3K4–JNK/p38 è stata implicata in decisioni alterate del destino cellulare e in risposte aberranti allo stress ossidativo e genotossico, a supporto della sua utilità come modulatore di via in studi meccanicistici.

MEK Kinase-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAP3K4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MEK Kinase-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAP3K4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAP3K4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MEK Kinase-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAP3K4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MEK Kinase-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MEK Kinase-4 nelle cellule tumorali con espressione di MAP3K4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.