MDM2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400045-ACT

MDM2 codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina che agisce come principale regolatore negativo di TP53, promuovendo l’ubiquitinazione di p53, l’esportazione dal nucleo e la degradazione proteasomiale per limitare le risposte al danno al DNA. Attraverso meccanismi di regolazione a feedback e l’integrazione con la segnalazione ATM/ATR, MDM2 influenza i checkpoint del ciclo cellulare, l’apoptosi, la senescenza e programmi trascrizionali adattativi allo stress. Un’espressione o un’attività di MDM2 deregolate possono modificare l’output della via di p53 e sono spesso oggetto di studio nei tumori, in cui alterazioni della proteostasi e del controllo dei checkpoint contribuiscono alla fitness delle cellule tumorali. MDM2 interagisce inoltre con ulteriori reti, inclusa la proliferazione mediata da RB/E2F e la segnalazione PI3K–AKT, rendendolo un nodo utile per la mappatura delle vie e la genomica funzionale.

MDM2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MDM2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MDM2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MDM2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MDM2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MDM2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MDM2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MDM2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MDM2 nelle cellule tumorali con espressione di MDM2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.