MCM2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421591-ACT

Mcm2 codifica la subunità MCM2 del complesso elicasi di mantenimento del minichromosoma (MCM2–7), una componente essenziale del macchinario eucariotico di “licensing” della replicazione del DNA. MCM2 partecipa all’assemblaggio del complesso di pre-replicazione alle origini di replicazione e supporta la progressione della fase S consentendo l’attivazione delle origini e lo svolgimento della forcella replicativa in coordinamento con CDC45 e il complesso GINS. La stretta regolazione dell’abbondanza di MCM2 e del suo caricamento sulla cromatina è collegata alle risposte allo stress replicativo, alla segnalazione ATR/CHK1 e al mantenimento della stabilità genomica. Un’attività o un’espressione deregolata di MCM2 è frequentemente associata a stati iperproliferativi e a instabilità cromosomica, rendendolo un marcatore ampiamente utilizzato e un nodo meccanicistico negli studi sul controllo del ciclo cellulare e sulle risposte al danno al DNA.

MCM2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Mcm2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MCM2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Mcm2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Mcm2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MCM2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Mcm2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MCM2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MCM2 nelle cellule tumorali con espressione di Mcm2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.